類器官是能夠在體外三維培養，并表現出相應器官生物學特征的“最小系統"。隨著類器官培養技術的不斷進步，應用也越來越廣泛。關于類器官構建原理、培養等方面的問題解答，希望能夠對各位小伙伴有所幫助。

基礎篇

Q1: 類器官培養對于起始細胞的來源有要求嗎？

A1: 目前培養的類器官主要來源于上皮細胞，對于非上皮細胞來源的類器官培養方式還需要進一步研究。

Q2: 類器官按照起始細胞的類型，分為幾種呢？

A2: 常見的類器官根據起始細胞的類型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；

（2）干細胞來源的類器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。

Q3: 類器官是由單一種類細胞組成的嗎？

A3: 類器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質的起始細胞進行分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝的結構，自組裝后的形態和功能與體內相應器官相似。

Q4：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細胞進行3D培養嗎？

A4：可以的。已有學者驗證過，將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復蘇和原代細胞提取，分別對細胞進行2D和3D培養，證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。

當然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養的選擇。

Q5：類器官可以像細胞一樣進行凍存和復蘇嗎？

A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。

Q6：類器官的尺寸需要進行控制嗎？

A6：是的，主要的原因是類器官內部缺乏循環系統。

當類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養成分的交換。因此這個結構尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內。未來的類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環系統，用以培養出更大尺寸的類器官。

圖1. TUNEL染色表明較大尺寸的類器官中心有大量細胞死亡（綠色），比例尺為100μm^【2】

Q7：類器官傳代的標準是什么？

A7：類器官的傳代通常是根據培養的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代，后續則每7-10天傳代一次^【3】。

Q8：類器官可以進行多少次傳代？

A8：大部分類器官可以在體外連續傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度^【4】。

Q9: 鑒定類器官的方法有哪些？

A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進行定向分化的？

A10: 在進行類器官培養前，我們需要了解該器官在體內的發育過程，及早期發育相關的信號通路。

以胃類器官培養為例：胃由前后腸發育而來，早期發育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式，指導激活/抑制相應的信號通路，來達到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化^【5】。

問：類器官原代培養的挺好的，一傳代就不行了是什么原因？

答：可能是傳代過程有樣本的丟失，因為基質膠重選后還是會有一些類器官在膠里，傳代的時候可以不用把基質膠wan全去除干凈，留一點。

問：除了T細胞，類器官還可以和哪些細胞共培養？

答：還可以和PBMC、成纖維細胞共培養

問：類器官復蘇的標準是什么？

答：類器官復蘇后，培養1周左右，可以正常進行傳代說明復蘇效果比較好。

問：類器官凍存的標準是什么呢？凍存需要多少類器官？

答：前5代建議是取2-3孔凍存為1管，1孔大概是20個類器官左右。

問：類器官鑒定的方法有哪些？

答：鑒定方式一是可以從組織層面進行，主要是組化鑒定；另外是分子層面，可以進行外顯子測序或者轉錄組測序等測序手段。

問：類器官培養成功的標準是什么呢？

答：目前還沒用一個統一的標準，一般類器官可以穩定傳代3代以上，說明干性是比較好的。

問：類器官長到多大可以做藥篩呢？

答：一般傳代后長到200-300um可以進行藥篩實驗

問：一個類器官試劑盒 可以養多少個類器官？

答：2-4個，100ml的培養基可以養200個孔。

問：類器官可以直接用細胞系培養嗎?

答：用細胞系培養的不能成為類器官，只能稱之為細胞球。

問：取材時為什么剔除脂肪組織？脂肪肝可以做類器官培養嗎？

答：脂肪組織影響后續消化分離得到的干細胞純度，脂肪肝也是可以做類器官培養的，消化前可以多清洗幾次，去掉表面脂肪。

問 ：類器官培養一定需要基質膠嗎？

答：基質膠主要是為類器官提供支撐作用和營養物質，基質膠主要成分有laminin，collagen IV，heparan sulfate proteoglycans。

問：如果要做藥篩需要額外去除基質膠和培養基嗎？

答：和傳代培養鋪板一樣，藥用培養基稀釋就可以。

問：類器官量多小的時候不需要加消化液？

答：一般是100um以下。

問： 想要CTC培養，需要多少樣本量呢？

答：至少50+個CTC，取樣時可以多取一些血，CTC細胞占比比較少。

問：原代培養中消化下來的細胞是只有干細胞嗎？

答：消化下來的細胞包含各個種類的細胞，但是能培養成類器官的只有成體干細胞和腫瘤干細胞，沒有干性的細胞在培養過程中不會增殖分化，養的過程會死掉。

問：初始量樣本量10*5，活性大于90%，可以培養出多少類器官？

答：培養一代，一般是24孔板的10個孔。

問： 類器官培養一代需要多長時間？

答 ：一般需要5-7天，長得快可3-5天。