HCMEC/D3 永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞如何培養(yǎng)？

hCMEC/D3 細(xì)胞系來(lái)源于人顳葉微血管，該微血管從手術(shù)期間切除的組織中分離出來(lái)，用于控制癲癇。初級(jí)分離物富含腦內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）。在第一個(gè)通道中，細(xì)胞通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)與人端粒酶催化亞基 (hTERT) 和 SV40 大 T 抗原依次永生化，然后通過(guò)有限稀釋克隆選擇性分離 CEC，并對(duì)克隆進(jìn)行廣泛的腦內(nèi)皮表型表征。這種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系代表了一種這樣的人類 BBB 模型，它可以很容易地生長(zhǎng)，并且可以對(duì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 相關(guān)的病理和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行細(xì)胞和分子研究。

保藏機(jī)構(gòu)

KCB; KCB 2019022YJ

 細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mLwan全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，Lwan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8mlLwan全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的Lwan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)怎么辦？

首先，要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁殖，培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混油。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。如果在鏡下現(xiàn)察細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒(méi)有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān):

(1)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)老，破碎的細(xì)胞殘骸:

(2)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不直細(xì)胞生長(zhǎng);

(3)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除;

(4)血清等級(jí)不足以維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)，更換高等級(jí)的胎牛血清。

相關(guān)熱門細(xì)胞：

WS0204H 人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞 HL-60

WS0205H 人胎盤絨膜癌細(xì)胞 BeWo

WS0206H 人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞 ACHN

WS0207H 人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞 Jeko-1

WS0208H 人肝星形細(xì)胞 LX-2

WS0209H 人鼻咽癌細(xì)胞 C666-1

WS0210H 人子宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 SiHa

WS0211H 人慢性髓系白血病細(xì)胞 K562

WS0212H 人皮膚成纖維細(xì)胞 BJ

WS0213H 人結(jié)腸癌細(xì)胞 LOVO

WS0214H 人肝癌亞力山大細(xì)胞 PLC/PRF/5

WS0215H 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 IMR-32

WS0216H 人口腔鱗狀細(xì)胞 WSU-HN30

WS0217H 人腦髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞 LN-229

WS0218H 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞永生化 hCMEC/D3

WS0219H 人鼻咽上皮細(xì)胞系永生化 NP69

WS0220H 人侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞 MUM2B

WS0221H 人永生化表皮細(xì)胞 HaCaT

WS0222H 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 HCC827

WS0223H 人多形性惡性膠質(zhì)瘤 T98G

WS0224H 正常人結(jié)腸組織細(xì)胞 CCD-18CO

WS0225H 人舌鱗癌細(xì)胞 CAL-27

WS0226H 人尤文氏肉瘤 RD-ES

WS0227H 人Burkkit淋巴瘤細(xì)胞 Daudi

WS0228H 　人卵巢癌細(xì)胞H HEY-A8

WS0229H 人膀胱癌細(xì)胞 RT-112

WS0230H 人胚肺細(xì)胞 MRC-5

WS0231H 人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-8

WS0232H 人成骨肉瘤細(xì)胞 Saos-2

WS0233H 人結(jié)直腸癌細(xì)胞 LS513

WS0234H 人橫紋肌肉瘤細(xì)胞 A-673

WS0235H 人喉癌細(xì)胞 LCC

WS0236H 人膽管癌細(xì)胞 HuCCT1

WS0237H 人B淋巴母細(xì)胞 HMy2.CIR

WS0238H 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SK-N-SH

WS0239H 人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞 SU-DHL-2

WS0240H 人胃癌細(xì)胞 Hs-746T

WS0241H 人急性淋巴母細(xì)胞性白血病細(xì)胞 MOLT-4

WS0242H 人膀胱移行細(xì)胞癌 J82

WS0243H 人乳腺癌細(xì) MDA-MB-175

WS0244H 人食管癌細(xì)胞 TE-7

WS0245H 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 Ishikawa

WS0246H 人結(jié)腸癌細(xì)胞 Caco2

WS0247H 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 RL120-2

WS0248H 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H196

WS0249H 人卵巢癌腺癌細(xì)胞 NIH:OVCAR-3

WS0250H 人急性髓系細(xì)胞白血病細(xì)胞 KG-1A

WS0251H 人黑色素瘤細(xì)胞 A2058

WS0252H 人肝癌細(xì)胞 SNU-387

WS0253H 人腦膜瘤細(xì)胞　 IOMM-LEE

WS0254H 人卵巢癌細(xì)胞 HO-8910

WS0255H 人食管癌細(xì)胞 TE-10

WS0256H 人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞 RD

WS0257H 人急性原粒細(xì)胞白血病細(xì)胞 KASUMI-1

WS0258H 人結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620

WS0259H 人前列腺癌細(xì)胞 PC-3

WS0260H 人小細(xì)胞肺癌 DMS-153

WS0261H 人胃癌細(xì)胞 NCI-N87

WS0262H 人葡萄膜黑色素瘤 92-1

WS0263H 人急性非B非T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞 Reh

WS0264H 人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116

WS0265H 人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231

WS0266H 人骨肉瘤細(xì)胞 SJSA-1

WS0267H 人Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞 RAJI

WS0268H 人T淋巴瘤細(xì)胞 H9

WS0269H 人膀胱癌細(xì)胞 5637

WS0270H 人喉癌細(xì)胞 TU212

WS0271H 人食管腺癌 OE-33

WS0272H 人肺癌細(xì)胞 A549

WS0273H 人甲狀腺癌細(xì)胞 KTC-1

WS0274H 人滑膜肉瘤細(xì)胞 SW-982

WS0275H 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Y79

WS0276H 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞 COLO320DM

WS0277H 人正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞 hTERT-HPNE

WS0278H 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞 RPMI-8226

WS0279H 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 A172

WS0280H 人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞 HuH-6

WS0281H 人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-453

WS0282H 人咽鱗癌細(xì)胞 FaDu

WS0283H 人食管癌細(xì)胞 Kyse510

WS0284H 人肝癌細(xì)胞 Hep3B

WS0285H 人卵巢癌細(xì)胞 Caov3

WS0286H 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 HEC-1-A

WS0287H 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞 NCM-460

WS0288H 人卵巢顆粒細(xì)胞 KGN

WS0289H 人骨肉瘤細(xì)胞 143B

WS0290H 人口腔鱗癌細(xì)胞 SCC-25

WS0291H 人胰腺癌細(xì)胞 PANC-03.27

WS0292H 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H647

WS0293H 人晶體上皮細(xì)胞 SRA01/04

WS0294H 人腎癌細(xì)胞 769-P