豬腎細胞系 LLC-PK-1 

DMEM+10%FBS+1%P/S  

貼壁生長

細胞培養基本知識

體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由于物種、個體遺傳背 景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術措施 亦不盡相同，現介紹個別組織細胞培養的要點如下：

上皮細胞培養

視網膜色素上皮細胞

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞，培養時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜， 因此培養在有膠原的底物上可能利于生長， 另外人或小鼠表皮細胞培養在以 3T3 細胞為飼養層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。以表皮細胞為例， 用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞， 其法如下：

1、 取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊， 早產流產兒皮膚更好， 取角化層薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小塊。

2、置 0.02%EDTA 中，室溫，5 分鐘。

3、換入 0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分鐘。

6、反復吹打，制成懸液。

7、培養：用 80 目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養基（Eagle 加 20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2 溫箱培養。

內皮細胞培養

人腦微血管內皮細胞

內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取 10—15 厘米長一段，如不能立即培養，可于 12 小 時內保存于 4℃。

2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。

3、用血管緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為 0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫 PBS 輕輕反復沖洗后，一 并注入離心管中（此步驟可重復） 。

5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫 箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

神經細胞培養

神經元與神經膠質細胞

神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象， 但很難使之增殖。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養，不僅能獲得生長的膠質細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質細胞在培養中生長不穩定，不易自發轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

一．設備：無菌操作設備。

二．大型設備

CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡：用于準確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術器械。

過濾器：配制解剖液、培養液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。

滲透壓儀：pH劑，天平等。

三．培養器皿及手術器械

1.培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2.培養板：24-40孔，可用于開放培養。

3.培養瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5.各類培養液貯存器。

6.小型手術器械。

準備

一.配制培養液

（1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。

（4）維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養物質。

二.培養基質

常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠。

三.消毒培養皿的備用

所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進行。

神經細胞分散培養

（一）選材

常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。

（二）取材

腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。

（三）細胞分離與接種

神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

（四）抑制膠質細胞生長

培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經膠質細胞的生長

肺微血管內皮細胞

II型肺泡上皮細胞

氣管上皮細胞

氣管平滑肌細胞

支氣管上皮細胞

支氣管平滑肌細胞

肺成纖維細胞

肺動脈內皮細胞

肺動脈平滑肌細胞

心肌細胞

主動脈內皮細胞

心肌成纖維細胞

心臟微血管內皮細胞

主動脈瓣膜間質細胞

冠狀動脈內皮細胞

冠狀動脈平滑肌細胞

頸動脈內皮細胞

頸動脈平滑肌細胞

食管上皮細胞

食管平滑肌細胞

食管成纖維細胞

胃粘膜上皮細胞

胃平滑肌細胞

胃成纖維細胞

小腸粘膜上皮細胞

小腸平滑肌細胞

小腸成纖維細胞

結腸粘膜上皮細胞

結腸平滑肌細胞

結腸成纖維細胞

膽囊上皮（永生化）細胞

膽囊上皮細胞

肝內膽管上皮細胞

肝外膽管上皮細胞

肝實質細胞

肝星狀細胞

肝竇內皮細胞

肝Kuffer細胞

直腸成纖維細胞

肝成纖維細胞

直腸上皮細胞

直腸平滑肌細胞

膽囊微血管內皮細胞

膽囊成纖維細胞

膽囊平滑肌細胞

膽囊動脈內皮細胞

食管癌細胞

食管纖維瘤細胞

腎小管上皮細胞

腎小球系膜細胞

腎小球內皮細胞

腎足細胞

輸尿管上皮細胞

輸尿管平滑肌細胞

膀胱上皮細胞

膀胱平滑肌細胞

膀胱成纖維細胞

前列腺上皮細胞

前列腺成纖維細胞

輸卵管成纖維細胞

甲狀腺上皮細胞

甲狀腺成纖維細胞

胰腺星狀細胞

胰島細胞

腎上腺皮質細胞

腎上腺包膜成纖維細胞

扁桃體動脈內皮細胞

扁桃體動脈平滑肌細胞

腮腺腫瘤細胞

扁桃體間質細胞

頜下腺囊腫細胞

甲狀腺微血管內皮細胞

扁桃體上皮細胞

扁桃體靜脈平滑肌細胞

扁桃體成纖維細胞

卵巢間質細胞

輸卵管上皮細胞

輸卵管平滑肌細胞

子宮內膜上皮細胞

子宮平滑肌細胞

乳腺上皮細胞

乳腺成纖維細胞

乳腺導管上皮細胞

乳腺癌（腫瘤）細胞

子宮內膜間質細胞

子宮瘤細胞

乳腺癌（腫瘤）干細胞

宮頸成纖維細胞

宮頸平滑肌細胞

卵巢囊腫細胞

宮頸上皮細胞

精原細胞  

睪丸白膜上皮細胞

睪丸白膜成纖維細胞

輸精管平滑肌細胞

附睪平滑肌細胞

附睪管上皮細胞

附睪成纖維細胞

宮頸癌細胞

睪丸支持細胞

子宮成纖維細胞

真皮成纖維細胞

角質形成細胞

前脂肪細胞

脂肪微血管內皮細胞

真皮毛乳頭細胞

豬腎細胞系 LLC-PK-1 

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的 重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細 胞群，在條件適宜下可生活 2－3 周，多用做原代培養，難以長期生存。

巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難 以建株。

培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞， 以小鼠腹腔取材法最為實用， 其法如下：1、實驗前三天，向小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯 lml（勿注入腸內！，以 ） 刺流產生大量的巨噬細胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁， 把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。

5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同時用手指從 兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動。

6、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側． 使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下 250g 離心 10 分鐘后，去上清，加 10ml Eagle 培養基。

9、計數細胞。每只鼠可產生 20 一 30×106 細胞，其中 90%為巨噬細胞。

10、以 3×105 個貼附細胞/平方厘米接種。

11、接種數小時后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用 Eagle 液沖洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培養液置 CO2 溫箱中。