名稱：奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基試劑盒

貨號(hào)：WS001-100-KIT/WS001-500-KIT

規(guī)格：100ml/500ml

品牌：WinSera

一、試劑盒組成：

二、使用方法：

1、 原代
（1）取材后的奶牛乳腺組織須在 2-8℃含有組織保存液 E的取樣瓶中，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離，拍照并登記信息。
（2）準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B備用。
（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養(yǎng)皿中，利用奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次后，利用眼科剪或手術(shù)dao將腫瘤組織jian切成體積約為1-3mm3的組織塊。
（4）組織用奶牛乳腺原代組織xiao化液 C消化，37℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個(gè)細(xì)胞或 70um 以下的細(xì)胞簇后，加入三倍體積奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B終止消化。
（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B重新重懸離心。
（7）基質(zhì)膠計(jì)算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠重懸鋪板。
（8）24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。
（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。
2、 類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液 B放置2min。
（2）移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）a. 類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)： 離心5min棄去上清，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。
b. 類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D消化2-3min，添加奶牛乳腺類器官緩沖液 B終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進(jìn)行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ul奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A。
3、類器官凍存
（1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液 B放置2min。
（2）移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清，添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B再次重懸，300g離心5min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例：密度為2個(gè)孔凍存1管，每管體積1.4ml。
（5）做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長期保存。
4、 類器官復(fù)蘇
（1）取10ml奶牛乳腺類器官培養(yǎng)緩沖液 B于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)全部融解。
（4）將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量奶牛乳腺類器官緩沖液 B重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質(zhì)膠重懸，每孔25ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500ul奶牛乳腺類器官培養(yǎng)基 A。

三、儲(chǔ)存/保存方法

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溫馨提示：本產(chǎn)品僅作科研實(shí)驗(yàn)使用，不支持臨床等研究